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微小RNA在椎间盘退变中的作用

归档日期:05-26       文本归类:分布透明性      文章编辑:爱尚语录

  椎间盘退变(IDD)的病因目前主要归结于环境因素和遗传因素之间的相互作用。值得注意的是,诸如机械负荷过重,体力活动和吸烟等环境因素只占IDD的一小部分。相反,遗传因素是超过74%退行性椎间盘疾病的主要危险因素。近些年来,随着学者们对腰椎退行性变研究的加深及分子生物学技术的发展,越来越多的证据表明,IDD的发生与微小RNA(miRNA)等这些小分子物质有关。研究发现与健康人相比,miRNA在IDD人群中的表达有明显的差异。微小RNA(miRNA)广泛存在于生物体内,具有高度保守性,并参与了机体内的多种病理生理过程。miRNA是由19~25个核苷酸构成的内源性非编码RNA,参与信使RNA稳定性和翻译的控制。它最初是在1993年由Ambros等发现的。MiRNA基因是一种非编码基因,其唯一转录产物是miRNA。miRNAs的异常调节参与多种疾病的发生和发展,包括多种癌症、心血管疾病及退行性疾病等。它在体内胚胎发生、调节细胞分化、增殖和凋亡等正常生理变化中发挥关键作用。本文结合国内外最新研究进展对miRNA与椎间盘退变的研究进展综述如下。

  椎间盘由三个形态不同的部分组成:髓核(NP),纤维环(AF)和软骨终板(CEP)。正常椎间盘富含大量细胞外基质和少量细胞,椎间盘属于体内最大的无血管结构,需要从椎间盘周围的毛细血管组织进行物质交换,部分细胞外基质合成和分解代谢失去平衡是导致NP细胞中蛋白聚糖和水分丢失并导致椎间盘退变主要的主要原因。蛋白聚糖含量的丢失通常被认为是椎间盘退变早期阶段的标志,并导致NP脱水和纤维化。细胞凋亡亦被称为I型程序性细胞死亡,以染色体浓缩,细胞收缩,DNA降解和凋亡小体形成为特征,大量证据表明细胞凋亡不仅存在于各种生理过程中,而且也广泛参与如骨关节炎、IDD等许多病理退行性疾病。NP细胞通过合成细胞外基质组分在维持椎间盘结构稳定性方面发挥关键作用。目前,凋亡相关的NP细胞数量减少被认为是IDD的重要病理机制。

  越来越多的研究表明NP细胞簇的形成和NP细胞的异常增殖在椎间盘退变中起到至关重要的作用。但这些细胞的异常增生机制仍不清楚,据文献报道miR-21在调节细胞增值起重要的作用,特别是在肝细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞当中。Liu等通过RT-PCR技术发现miR-21在人类退变的退变的椎间盘NP组织中表达量明显升高。进一步研究发现miR-21通过负向调控其靶基因PTEN的表达激活PI3K/Akt信号通路,促进NP细胞异常增殖。除此之外miR-21的过表达也可以促进细胞周期蛋白D1高表达。除miR-21以外,miR-10b也可以调控细胞增殖,作为一种多功能miRNA,miR-10b在许多组织或细胞类型中高度表达,特别是恶性肿瘤细胞当中。

  据报道miR-10b的失调与肿瘤进展和预后不良密切相关。同样的miR-10b与退行性人类NP细胞的增殖密切相关。Li等人在50例退变椎间盘和4例特发性脊柱侧凸患者的NP组织中发现在退变椎间盘NP组织中明显上调,并且通过分子生物学的方法发现HOXD10是miR-10b的靶基因。miR-10b可通过靶向沉默HOXD10激活Rhoc-Akt信号通路,促进椎间盘退变的NP细胞的异常增殖,miR-10b的抑制可能是预防退变的椎间盘组织中NP细胞异常增殖的新的治疗靶点。miR-184直接靶向与GAS1结合。miR-184的过度表达使GAS1下调,诱导Akt磷酸化并促进NP细胞增殖。另外,与对照组相比,miR-184在退行性NP组织中显著上调。总体而言,miR-21,miR-10b,和miR-184负向调节其靶基因以介导Akt途径并调节IDD期间的NP细胞增殖。这些miR⁃NAs的表达在IDD患者中显著上调,这表明miR-10b,miR-21和miR-184可能被用作IDD早期诊断的生物标志物。

  在健康的椎间盘中,细胞外基质(ECM)的合成与降解始终处于一种动态平衡状态。当ECM的分解代谢超过或者合成降低时,会导致椎间盘退变。胶原蛋白和蛋白聚糖的逐渐较少通常被认为是IDD的主要病理特征,基质金属蛋白酶(MMPs)和血小板反应蛋白整合素金属肽酶(ADAMTS)是降解ECM组分的主要蛋白酶。许多MMPs和ADAMTSs成员在退行性椎间盘组织中高表达,其水平与椎间盘退变程度正相关,最终导致椎间盘高度下降、组织韧性降低等一系列病理改变。

  Zhang等报道在退变椎间盘NP中miR-155表达水平与退变程度成负相关。进一步研究发现MMP-16是miR-155的靶点,miR-155的下调导致MMP-16上调、上调的MMP-16进一步降解聚集蛋白聚糖和II型胶原,导致椎间盘脱水和变性。Yan等在人类NPsv细胞中发现miR-100通过与FGFR3mRNA的3′-UTR靶向结合抑制其翻译进而激活MMP-13,促进细胞外基质的降解。Hua等人也用同样的方法发现miR-127-5p通过下调MMP-13的表达水平从而促进Ⅱ型胶原的表达,这表明MMP-13可作为人类IDD的一种新的治疗靶点。Jing等发现mir-93表达与特发性脊柱侧弯患者的NP细胞比较在椎间盘退变患者的NP细胞中显著下调。进一步研究发现MMP-3基因是mir-93的直接靶点,过表达的miR-93直接与MMP3的3′-UTR结合抑制其表达,进而促进NP细胞中的II型胶原蛋白增多。Tan等人发现miR-665在退变的椎间盘中高表达,高表达的miR-665通过作用于GDF5以促进NP细胞增殖及增加MMP-3和MMP-13的表达,进一步降低细胞外基质。Zhang等发现在IDD当中miR-3150a-3p的表达量明显增高,进一步研究发现miR-3150a-3p通过靶向与ACAN(属于蛋白多糖家族)基因相结合抑制NP细胞当中的ACAN从而导致腰椎间盘退变。

  综上可得,蛋白水解酶MMP-9、MMP-16、MMP-3、MMP-13、ACAN参与退变椎间盘细胞外基质降解,从而继发IDD等一系列病理变化,这使这些因子成为IDD发病机制的研究热点。除了介导MMP与ACAN表达之外,miRNA还可以通过调控另一种血小板反应蛋白解整合素金属肽酶(ADAMTS)的表达干预IDD的病理过程。Kang等报道通过与正常对照组相比,miR-15b在椎间盘退变的NP组织和用IL-1β刺激的NP细胞中上调。过表达的miR-5b通过靶向与SMAD3结合抑制其表达,并且上调IL-1β诱导的的的NP细胞中的AD⁃AMTS4、ADAMTS5、MMP3、和MMP13的mRNA和蛋白水平。抑制miR-15b表达后的NP细胞用IL-1β处理后这些因子的表达显著下调,这提示可以通过抑制miR-15b的表达抑制或下调由炎症因子介导的基质酶的表达,从而保护人类椎间盘外基质。上述研究提示,miRNA是通过调控基质降解酶的合成来调控椎间盘细胞外基质合成与降解,从而延缓IDD的发展,因此,通过基因工程使上述失调的miRNA正常表达,有望恢复细胞细胞外基质的合成与降解平衡,从而延缓或逆转已退变的椎间盘组织。

  在IDD中,许多炎性细胞因子,包括白细胞介素-1b(IL-1b)、IL-6和IL10,以及组织坏死因子-α(TNF-α)等也参与IDD的发病机制。与MMP或ADAMTS不同,这些炎性细胞因子通过诱导基质降解酶、细胞凋亡、细胞衰老及氧化应激等促进IDD的发生发展。研究人员发现,miRNA可通过调控炎性因子的表达来介导IDD的发生发展,在用LPS刺激的NP细胞中TNF-a,IL-1,IL-6和PGE2的mRNA的含量,转染miR-194后这些因子的含量明显下降,进一步研究发现过表达的miR-194可以沉默NP细胞及用LPS刺激后的NP细胞中的TRSAF而下调TNF-a,IL-1,IL-6和PGE2的表达水平,这提示miR-194对LPS介导的IDD具有保护作用。

  有研究发现用LPS刺激NP细胞会使miR-589-3p表达上调,抑制miR-589-3p基因,进而可下调TNF-α,IL-1β和IL-6的表达,抑制LPS诱导的细胞凋亡、增加聚集蛋白聚糖及II型胶原蛋白的表达。从而证明miR-589-3p可通过靶向抑制Smad4基因的表达促进IDD的发生。Kang等应用qPCR检测发现退变椎间盘组织中miR-15b表达上调,且应用IL-1β刺激NP细胞也会使miR-15b上调,通过共转染antagomiR-7和GDF5siRNA发现高表达的miR-7作用于GDF5可增强IL-1β介导的细胞外基质降解。通过共同转染miR-15b抑制剂与siSMAD3发现,高表达的miR-15b作用于SMAD3可增强IL-1β介导的细胞外基质降解。以上研究表明miRNA通过不同的方式和途径在IDD病理发生机制中起着重要作用,为今后治疗IDD提供了新的治疗思路。

  软骨终板是由一个薄层透明软骨组成,是椎间盘组织的主要营养供给途径。由于椎间盘是人体内最大的无血管结构,故它依赖于软骨终板进行营养物质和代谢物质运输交换,终板通透性的降低可能导致合成代谢和分解代谢过程之间的不平衡,导致细胞外基质的改变和软骨细胞的凋亡。除此之外,软骨终板还提供生物力学支持,因为它均匀分配了椎间盘内压力。即使是很小的软骨终板破坏也会导致椎间盘内压力的分布不均匀。异常压力可进一步破坏椎间盘细胞的正常代谢。因此,许多研究人员认为软骨终板降低可能导致或加速椎间盘的退行性改变。

  然而,迄今为止尚未完全阐明CEP变性的确切机制。我国研究人员首次通过microRNA芯片差异表达分析发现在发生退变的颈椎间盘软骨终板中有22种显著上调的miRNA和19种显著下调的miRNA,进一步研究证实miR-140表达量较正常终板显著下调。在颈椎终板软骨细胞中miR-140同时通过靶向沉默DNPEP和ADAMS5基因抑制DNPEP介导的软骨发育信号通路和减少软骨终板基质降解酶的合成从而延缓软骨终板的退变。同样地,在退变的颈椎间盘软骨终板组织中,Zhan等发现miR-625的表达水平显著上调,并通过转染荧光素酶报告质粒的技术发现Bcl-2基因为其靶基因,证实了上调miR-625通过作用于Bcl-2基因促进Fas介导的软骨终板细胞凋亡。Shen等采用qPCR技术发现在退变椎间盘软骨终板细胞中miR-221的表达水平显著上调,并通过转染荧光素酶报告质粒的技术发现E2α(7-β-雌二醇)基因为其靶基因,证实了上调miR-221通过作用于E2α基因促进减弱刺激对椎间盘的保护作用,导致终板细胞凋亡。

  IDD的发生和发展是一个多因素和复杂的过程。大量研究表明,miRNA表达的改变与各种疾病密切相关,包括癌症、心血管疾病、炎症和自身免疫性疾病和肌肉骨骼疾病。据报道,miRNA具有稳定的特性和组织特异性,因此可用作基于血液的疾病诊断的生物标志物。迄今为止,已经鉴定出超过100种miRNA与疾病的病因学和病理学相关。人免疫系统中的miRNA不仅调节T/B细胞分化、发育,中性粒细胞和单核细胞增殖,还影响炎症内细胞因子的分泌。因此,miRNA参与了许多疾病,并具有调节疾病发展和诊断的潜力;miRNA的检测将会是特定疾病早期诊断的潜在方法。

  目前miRNA治疗椎间盘突出的实验研究已取得令人振奋的成果,但离真正的用在临床还有很多困难和需要解决的问题:①目前对涉及IDD的miRNA的研究仅限于NP细胞及软骨细胞。然而纤维环细胞的病理变化在椎间盘退变当中也起着重要作用。未来的研究还应该关注在IDD中miRNA对纤维环细胞的影响;②像细胞凋亡、基质分解、细胞增殖和炎症反应一样,血管生成、新神经、氧化应激、细胞衰老和自噬也在椎间盘退变当中发挥着关键作用,miRNA是否也对这些病理过程产生影响尚不清楚;③据目前所知,基于miRNA的椎间盘退变的治疗潜力主要来自体外实验。在动物模型和退行性椎间盘疾病患者中仍然缺乏研究。因此,需要临床试验来更好的验证miRNA靶向治疗的有效性和安全性,以为早期椎间盘退变提供手术干预的替代方案;④确定miRNA治疗的准确使用计量,更有效的避免miRNA治疗中的不良反应。相信未来随着分子生物学发展临床开展miRNA治疗椎间盘退变将为期不远。

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